染(ran)色(se)體標本制(zhi)備經驗(yan)手冊
3.0版本
上海欣諭儀器(qi)有限公司
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目 錄
第一部分(fen)
人類染色(se)體研究的實驗室建設………………1頁
第二部分
各(ge)類器(qi)械清洗(xi)與常用試劑配置………………4頁
第三部分
人類染(ran)色體(ti)標(biao)本制備方法……………………11頁
第四部(bu)分(fen)
探討染色體標本制備技術(shu)中的(de)若干問題……22頁
第五部(bu)分
附(fu)錄……………………………………………25頁
第一部(bu)分
人類染色體研究的(de)實驗室(shi)建設(she)
一、實驗室要求
1、準(zhun)備(bei)室（約30平方米）：供清洗玻璃儀器、配制試劑儀器包裝消毒及制片場所，還必需配置耐酸堿水池、實驗操作臺、藥櫥等設施。并能合理放置冰箱、電熱干燥箱、離心機、純水器、消毒鍋、天平等儀器，以方便使用。
2、無菌室(shi)（約(yue)25平方米）：用作細胞的接種培養、配備培養基。分為更衣室（約4平方米）、緩沖室（約6平方米）、接種室（約15平方米）。配備空調機、傳遞窗、離心機、倒置顯微鏡、超凈工作臺、臭氧發生器或紫外燈、培養箱等設備儀器。
3、分(fen)析室（約15平方米）：為觀察分析核型、整理資料場所。配備高清晰度帶照相裝置的顯微鏡，電腦、打印機、辦公桌等。
二、設備(bei)儀器
（一）儀器
1、超凈工作(zuo)臺(tai)一臺(tai)
2、光學顯微(wei)鏡二臺（可(ke)以安裝染色(se)體(ti)軟(ruan)件(jian)分析系統）
倒(dao)置顯微鏡與帶照相裝(zhuang)置的(de)正(zheng)立顯微鏡各(ge)一臺。倒(dao)置顯微鏡用作(zuo)細(xi)胞培養(yang)；正(zheng)立顯微鏡用作(zuo)核型分(fen)析，有條件(jian)的(de)單位可配備染色(se)體分(fen)析軟件(jian)、電腦、打印機等。
3、 隔水式恒溫培養箱一(yi)臺
開(kai)展產前(qian)檢查的單位(wei)，Z好購買二(er)氧化(hua)碳(tan)培養箱。
4、電(dian)熱干燥箱一(yi)臺(tai)
5、冰箱(xiang)二(er)臺(tai)：普通冰箱(xiang)和(he)低溫冰箱(xiang)各一臺(tai)
6、酸度(du)計一臺（可(ke)略）
7、純水器（電阻率18兆歐(ou)姆）一臺(tai)；（可略）
8、高壓滅菌鍋一臺（可略）
9、電(dian)熱(re)磁力(li)攪拌器(qi)一臺（可略）
10、真空泵（無(wu)油）一臺(tai)（可略）
11、電子天(tian)(tian)平(ping)二臺(tai)（萬分之一天(tian)(tian)平(ping)與普通天(tian)(tian)平(ping)各一臺(tai)）
12、水平式離(li)心機二(er)臺
轉速0-4000轉/分，10毫升/管，大容量與小容量各一臺。大容量的供制片用，小容量的放置無菌室供細胞培養用。
13、 可調移液器若干支：規格(ge)從5-5000微升若干支
14、超聲(sheng)波清洗器一臺（可略）
15、水浴箱（0-100℃可調）
（二）玻璃(li)器皿與耗材(cai)
1、培養瓶：15毫升鏈(lian)霉素(su)瓶，25毫升小方瓶（建議(yi)采用(yong)一次(ci)性培養瓶）。
2、刻度離心管（10毫升）50支
3、量筒（10-1000毫升）：各種規格各一個。
4、不(bu)銹鋼濾(lv)器（各種規(gui)格各一個）及濾(lv)膜(mo)（孔徑中0.25微米(mi)）一盒(he)
5、注射器(qi)（1-20毫升）若干(gan)
6、鹽水瓶(ping)（100-500毫(hao)升(sheng)）若干(gan)
7、試劑(ji)瓶（磨(mo)口）10個
8、蒸餾水瓶（3萬(wan)或(huo)5萬(wan)毫升(sheng)）2個
9、染色缸1個
10、研(yan)缽1個(ge)
11、酒(jiu)精(jing)燈2盞
12、滴管（帶(dai)吸頭(tou)）50支
13、載玻片若干
14、試管(guan)架和離心管(guan)架各(ge)2個
15、各種鑷子與剪刀若干
16、鋁(lv)飯盒(he)（供盛培養瓶滴管等器械消毒時使用(yong)）
17、燒杯（容量50-2000毫升(sheng)）各一個(ge)
18、抽濾瓶（1000-2000毫升(sheng)）一(yi)個(ge)
19、各種規(gui)格的可調(diao)移液器吸(xi)頭若(ruo)干
20、載波(bo)片盒（50-100片）若干
* 玻(bo)璃器(qi)材(cai)的材(cai)質(zhi)應采用中性硬(ying)質(zhi)玻(bo)璃或硼硅玻(bo)璃
三、常(chang)用藥品(pin)及試劑
1、培養基（RPMI 1640、HamF10）
2、植物凝集素（phytohemagglutinin簡稱(cheng)PHA）
3、肝素(su)鈉（抗(kang)凝(ning)劑，醫用(yong)級）
4、血清(qing)（小牛血清(qing)、胎牛血清(qing)）
5、抗菌素(su)（青霉素(su)、鏈霉素(su)）醫用級
6、秋(qiu)水仙素（秋(qiu)水仙堿）
7、氧化鉀(jia)（分析(xi)純）
8、碳酸氫鈉（分析純）
9、磷酸二氫(qing)鉀和磷酸氫(qing)二鈉（分析(xi)純）
10、乙(yi)二胺四乙(yi)酸二鈉（EDTA，分(fen)析(xi)純）
11、三羧甲(jia)基(ji)氨基(ji)甲(jia)烷（Tris，分析純）
12、 胰蛋白酶
13、 酚(fen)紅
14、 姬姆沙染料（Giemsa）
15、 甲醇(chun)（分(fen)析純）
16、 冰醋酸（冰乙酸）（分析純）
17、 重酪酸鉀(jia)（化(hua)學純）
18、 濃硫酸(suan)（工業級）
19、 香柏油
20、 甘油（分析純）
21、 乙醇（無水和純度95%，化學純）
22、 乙醚（無水(shui)，化學純）
23、 生長因子(zi)（堿性成纖維(wei)細胞因子(zi)bFGF、表皮細胞生長因子EGF）
24、 氫(qing)氧化鈉（分析純）
25、 檸檬酸鈉(na)（分析純）
第二(er)部(bu)分
各(ge)類器械(xie)清洗與常用試劑配置(zhi)
一(yi)、各類器(qi)械清洗處理
1、清洗液配置
清洗液(ye)配方
配方(fang)試劑 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
重鉻酸鉀（克） | 60 | 60 | 80 | 100 | 200 |
工業硫酸（毫升） | 90 | 460 | 100 | 800 | 500 |
水 （毫升(sheng)） | 750 | 300 | 1000 | 200 | 500 |
方法：先將(jiang)重酪(lao)酸鉀溶于水中，再慢(man)慢(man)加入工業(ye)濃硫酸。
注(zhu)意：配制時(shi)會產生高熱(re)，應采用(yong)(yong)耐高溫材(cai)料配制。配制人員(yuan)要做好(hao)防護措施（如配帶(dai)保護眼鏡、耐酸手套等）貯存(cun)清(qing)洗液的容器一(yi)定要帶(dai)蓋(gai)子，防止清(qing)洗液不斷吸(xi)收空氣的水分，而變質失效(xiao)。容器的材(cai)質可選用(yong)(yong)陶瓷(ci)或耐酸硬塑。
* 配(pei)制(zhi)時切記(ji)不能將(jiang)水倒(dao)入硫酸(suan)里(li)！配(pei)方3較為廣(guang)泛(fan)使用(yong)。
2、玻璃器皿清(qing)洗(xi)
新(xin)的玻璃器皿(min)先用清(qing)(qing)水(shui)沖干(gan)(gan)(gan)凈，再在清(qing)(qing)潔劑（如(ru)洗(xi)衣粉(fen)、洗(xi)潔精等）溶液中，用毛刷徹(che)底刷干(gan)(gan)(gan)凈，然后清(qing)(qing)水(shui)沖凈。晾(liang)干(gan)(gan)(gan)（如(ru)有(you)超聲(sheng)波清(qing)(qing)洗(xi)器，可將器皿(min)用清(qing)(qing)水(shui)沖凈后放入(ru)超聲(sheng)波清(qing)(qing)洗(xi)器中清(qing)(qing)洗(xi)后，清(qing)(qing)水(shui)沖凈晾(liang)干(gan)(gan)(gan)）。再用5-10%HCL（濃HCL原液濃度約36%）泡過夜后，沖凈烘干，再泡入清洗液中24小時（注意泡入的器皿內不能有氣泡），再用清水徹底沖凈，然后用蒸餾水沖凈（普通器皿沖五遍），用作細胞培養的器皿（如培養瓶等）蒸餾水沖凈后，再用三蒸水沖兩遍以上，烘干。用純棉布或無毒的硬紙包裹，高壓高溫滅菌備用。舊的玻璃儀器的清洗，可免去中間用5-10%HCL浸泡過夜這一步驟，其余的處理方法仍要保留。
3、橡(xiang)膠類制品(pin)的清洗
橡膠制品（如(ru)橡膠塞(sai)等）先用清水刷(shua)洗，再用2%NaOH煮沸20分鐘，清水沖凈過透。再用2%HCL煮沸20分鐘后，自來水沖洗10分鐘，用蒸餾水過三遍后，再用蒸餾水浸泡24小時，取出80℃以下烘干，包裝消毒備用。
* 器皿的(de)清洗是整個(ge)實驗的(de)關鍵性(xing)的(de)第一步。
4、載(zai)玻片的清(qing)洗處理
把(ba)玻片逐(zhu)片用(yong)皂粉液(ye)洗(xi)刷(shua)干(gan)凈（用(yong)粗紗布(bu)刷(shua)，不(bu)要(yao)用(yong)毛刷(shua)）或(huo)逐(zhu)片放入(ru)超聲波清洗(xi)器內(nei)清洗(xi)后，自來水徹底沖凈后，晾干(gan)。逐(zhu)片放入(ru)清洗(xi)液(ye)中浸泡24小時，取出后用自來水徹底沖凈，泡蒸餾水一天，取出放入盛有80%乙醇的容皿（帶密封蓋）內保存備用。
*玻(bo)片的(de)清潔直(zhi)接影響染色體鋪(pu)展(zhan)、形(xing)態及背景的(de)清晰(xi)；玻(bo)片之間粘在一起時，密封程(cheng)度高，皂液(ye)(ye)和(he)清洗液(ye)(ye)無法侵(qin)入(ru)，故要逐片侵(qin)入(ru)。
5、金屬器(qi)材
金屬器材一般可用(yong)(yong)酒精擦(ca)凈(jing)后(hou)(hou)，高(gao)壓高(gao)溫滅菌后(hou)(hou)備用(yong)(yong)，也可用(yong)(yong)含有(you)0.5%亞硝酸鈉的1：1000的新潔爾滅溶液中浸泡滅菌（30分鐘以上）。
二、常(chang)用試劑的(de)配(pei)制
1、培(pei)養基(ji)RPMI1640配制(zhi)
培(pei)養基由多中氨(an)基酸、維生素(su)、生物素(su)、無(wu)機(ji)鹽等按不同比例配置而(er)成，再(zai)加入(ru)酚紅(hong)作指示(shi)劑是細胞體(ti)(ti)外培(pei)養的(de)必要(yao)營養素(su)。
稱取10.4克RPMI1640干粉，加入新制備的三蒸水（電阻率18MΩ）900毫升，用磁力攪拌器攪拌約2小時（不能加熱），使粉末充分溶解，用NaHCO3 （約(yue)2克）調PH=7.2（用PH計測量），再用1000毫升容器瓶進行定容，在無菌室內抽濾滅菌、分裝，于4℃冰箱保存，長時間不用，應置-20℃冰箱保存。
2、培養基Ham F10配制(zhi)
按說明書的量稱取(qu)Ham F10干粉，配制方法和要求與RPMI1640的配制方法相同，不同之處是，用作羊水細胞的F10培養液體，用NaHCO3調PH=6.7。而用作外周血培養基的F10培養液，則用NaHCO3調PH=7.2。
* 配(pei)制培(pei)(pei)養基的蒸餾(liu)水(shui)一定要新鮮(xian)，純度達18MΩ；配(pei)好后要盡快過濾滅菌(jun)，以(yi)免細菌(jun)大量(liang)繁殖影(ying)響培(pei)(pei)養液的質(zhi)量(liang)。
3、抗(kang)凝(ning)劑
抗凝劑(ji)常采用(yong)的(de)是肝(gan)素(su)，肝(gan)素(su)是一種多糖，能阻(zu)止白細(xi)胞(bao)和(he)淋巴細(xi)胞(bao)與紅細(xi)胞(bao)集結在一起(qi)而影(ying)響培養的(de)質(zhi)量(liang)，但肝(gan)素(su)濃度太高會導致溶(rong)血(xue)。一般劑(ji)量(liang)是100單位肝素液可抗凝5毫升血液。
配(pei)制：取(qu)靜(jing)脈注射用肝素安(an)瓿一(yi)支（含12500G際單位），在無菌條件下，用滅菌生理鹽水稀釋25倍即500單位/毫升，分裝備用。每管分裝0.2毫升（即100單位），可抗凝5毫升外周血。也可用肝素鈉粉劑（每毫克130單位）。取450毫升肝素鈉溶于100毫升生理鹽水，即為585單位/毫升。高壓滅菌備用。
4、植物凝集素（phytohemagglutinin簡稱PHA）
PHA是從豆(dou)子(zi)（四季豆(dou)、雞子(zi)豆(dou)、雪山豆(dou)等豆(dou)子(zi)都含(han)有(you)豐富的(de)(de)PHA）提取出來的(de)(de)，其化學(xue)成分為糖蛋白，具(ju)有(you)刺(ci)激淋巴(ba)細胞(bao)(bao)進行有(you)絲分裂的(de)(de)作用(yong)(yong)(yong)。PHA用(yong)(yong)(yong)量(liang)(liang)不足(zu)影響分裂細胞(bao)(bao)的(de)(de)數(shu)量(liang)(liang)，用(yong)(yong)(yong)量(liang)(liang)過(guo)高(gao)，則使(shi)培養(yang)的(de)(de)外周血凝集而影響淋巴(ba)細胞(bao)(bao)生(sheng)長(chang)，使(shi)用(yong)(yong)(yong)前(qian)一定(ding)(ding)要清楚(chu)所使(shi)用(yong)(yong)(yong)PHA產品的(de)(de)正(zheng)確(que)用(yong)(yong)(yong)量(liang)(liang)，各廠家生(sheng)產的(de)(de)PHA的(de)(de)活性存在著(zhu)差異，故使(shi)用(yong)(yong)(yong)量(liang)(liang)有(you)一定(ding)(ding)的(de)(de)差異。
配制：若購買(mai)已滅菌(jun)的PHA，可在無菌條件下直接用培養液（不含血清）溶解，按說明書上的使用量直接加入到培養液中。若購買的是未除菌的PHA粉末，則用生理鹽水溶解后，再過濾滅菌后使用。
5、秋水仙(xian)素（Colchicine,紡錘(chui)體抑制劑）
秋水仙素(su)是從地(di)中(zhong)海的一種名叫(jiao)秋水仙（colchicum）的鱗莖中提取的一種植物堿，它的作用：
（1）抑制細胞紡錘體的形成，使細胞分裂停止在中期，從而起到積累大量中期細胞的作用。
（2）使染色體單體縮短分開，呈現明顯的外形。秋水仙素的使用濃度范圍比較寬，可差幾十倍之多，一般終濃度為0.2-0.5微克/毫升。處理4-6小時。秋水仙素作用時間越長，被阻止的中期細胞越多，但染色體也會收縮，收縮過度會影響形態。
配制：稱(cheng)取秋水仙素4毫克溶于40毫升生理鹽水，即配成100微克/毫升，高溫高壓滅菌后分裝備用，5毫升培養物中加入0.01毫升或0.02毫升，使Z終濃度為0.2微克/毫升或0.4微克/毫升。
秋(qiu)水(shui)仙(xian)胺是人工合成的一種(zhong)秋(qiu)水(shui)仙(xian)素的衍生(sheng)物(wu)，它的功效與秋(qiu)水(shui)仙(xian)素是一樣，但對細胞的毒(du)性作(zuo)用只是秋(qiu)水(shui)仙(xian)素的幾十分之(zhi)一。
* 因秋水(shui)仙素具有一(yi)定的毒性(xing)和致癌作(zuo)用(yong)，故配制使用(yong)時做(zuo)好防護措施。
6、低滲液
低滲(shen)液的作用：能使(shi)細胞膨脹，便于染色(se)體分(fen)散而易(yi)于觀察(cha)和計數，常用0.075M KCL作低滲溶液，優點是：
（1）染色體輪廓較清楚
（2）染色性增強，可以縮短染色時間
（3）用于G帶技術更能顯示其優越性
配制(zhi)：稱取2.795克KCL，加雙蒸水至500毫升，溶解。4℃冰箱保存。
7、固定液
固定液的(de)作用(yong)是穩(wen)定染色體的(de)形態(tai)結(jie)構(gou)，清(qing)除染色體外層物質(zhi)對染色體在玻(bo)片上展(zhan)開(kai)的(de)影(ying)響，通過更(geng)換固定液2-3次，清除紅細胞的碎片，使標本片的背景更為清晰，廣泛使用的固定液是甲醇和冰醋酸的混合物，二者的比例是甲醇∶冰醋酸=3∶1，現用現配。每次固定時間至少為30分鐘，已固定的細胞在固定液中置冰箱4℃密封保存一個月也不會變質。
8、EDTA-胰酶消化(hua)液(ye)
用于消(xiao)化貼壁生長的成(cheng)纖(xian)維細(xi)胞，使細(xi)胞從瓶壁脫落便于收(shou)
集或傳(chuan)代培養。
配制：
（1）貯存液：NaCl 8克
KCL ; 0.4克
葡萄(tao)糖(tang) 1克
NaHCO3 0.58克
胰(yi)酶 ; 0.5克
EDTA 0.2克(ke)
依次(ci)溶于90毫升三蒸水中，并加入1%酚紅0.2毫升作指標（也可以不加酚紅），再加入三蒸水定量至100毫升，過濾滅菌，分裝置-20℃冰箱保存。
（2）工作液：
取貯存液1毫升加無菌三蒸水或培養液9毫升即可，EDTAZ終濃度為0.02%，胰酶Z終濃度為0.05%，處理時間約30秒左右（應以鏡下觀察細胞變圓即可終止作用）。
9、胰蛋白酶保存(cun)液(ye)（G顯帶）
（1）0.25%胰酶液
稱(cheng)取胰酶2.5克，加生理鹽水（或雙蒸水）1000毫升，充分攪拌溶解（約2小時），按每份60毫升分裝（根據G顯帶時所用的容器的容量來分，一般采用立式染片缸），冰凍保存。（使用方法見后）
（2）2%胰酶液
稱(cheng)取胰酶2克，用100毫升生理鹽水（或雙蒸水）充分攪拌溶解，按每份5毫升分裝冰凍保存備用。（使用方法見后）
* 胰酶的配制(zhi)(zhi)要(yao)注意(yi)兩點：一是要(yao)充分溶解，這(zhe)一過程(cheng)一般會觀(guan)察到溶液由(you)混濁(zhuo)變澄(cheng)清；二是配制(zhi)(zhi)時間(jian)也(ye)不能過長，常溫下，胰酶液較(jiao)容易受細菌(jun)污染，細菌(jun)數(shu)量太多(duo)，會影(ying)響(xiang)胰酶效價。如果只是外用顯帶，不需要(yao)過濾除菌(jun)，但應盡快分裝，冰凍(dong)保(bao)存(cun)。盡量降低細菌(jun)的污染程(cheng)度(du)。
10.磷酸緩沖液（濃度為0.07M，PH=7.4）
人類染色體較容易被堿(jian)性染料(liao)染色，采(cai)用(yong)偏堿(jian)的(de)磷(lin)酸(suan)緩沖液(ye)
配成姬姆(mu)薩染(ran)(ran)色(se)液染(ran)(ran)色(se)，使得(de)標(biao)本(ben)片中的染(ran)(ran)色(se)體(ti)和(he)細胞核呈現鮮艷的紫藍(lan)色(se)，其形態與(yu)帶型(xing)更(geng)為(wei)清晰(xi)。
方法：
甲液(ye)：磷酸二氫鉀（KH2PO4）9.078克加雙蒸水至1000毫升。
乙液(ye)：磷酸(suan)氫二鈉（NaHPO4·2H2O）11.876克(ke)（如果是帶12個水(shui)(shui)分子的Na2HPO4·12H2O則稱(cheng)取(qu)23.87克(ke)）加雙(shuang)蒸水(shui)(shui)至1000毫升溶(rong)解。
取甲溶液(ye)18.2毫升、乙液81.8毫升混勻即配成100毫升PH=7.4磷酸緩沖液。
* 上述(shu)溶(rong)液都(dou)可以配(pei)好備用。只要(yao)沒有出現沉(chen)淀物，勻可繼續使(shi)用。于4℃冰箱(xiang)保存，使(shi)用期(qi)會長些。
11．姬姆薩(sa)（Giemsa）工作液
（1）Giemsa原液配方：姬姆薩染料 1克
甘油 50毫升
甲醇(chun) 50毫升
方法(fa)：先(xian)將(jiang)姬姆薩染料加少許甘油(you)用研缽充分研磨，逐步加入余下的甘油(you)，置55℃水浴2小時，并不斷研磨攪勻，使其充分溶解。冷卻后，再加入50毫升甲醇混勻。置帶蓋的瓶子中（經常搖動瓶子，使染料溶解得更好），兩周后，用定性濾紙（或普通粗濾紙）過濾即可。另一方法：將染料邊研磨邊加足甘油后，室溫下放置2天左右，期間要經常將其攪勻，再加入50毫升甲醇攪勻，兩周后，用定性濾紙（或普通濾紙）過濾備用。此法免去了55℃毫升加熱2小時這一步驟，但配制時間較長些。
* 因甘油(you)和甲(jia)醇具有吸水性、揮(hui)發性，原(yuan)液(ye)Z好(hao)室溫下密封保存(cun)。
（2）工作液配方：姬姆薩原液:磷酸緩沖液=1:6（或以上）
* 工作液Z好現用現配，各(ge)實(shi)驗室的G顯帶方法各(ge)有(you)差(cha)異(yi)，染(ran)料的質量也有(you)差(cha)異(yi)，故(gu)工作液的稀釋比例根據實(shi)際情況來定。一(yi)般(ban)情況下，濃度(du)越高(gao)，染(ran)色時(shi)間越短(duan)；反之，則越長。過濃
稀都會(hui)影響顯(xian)帶的質量。
12．0.2 N鹽酸(suan)溶液配制
稱鹽酸原液（約12N）HCL（AR）1毫升加雙蒸水至60毫升，攪勻即可。
13．1%或5%氫氧化(hua)鋇Ba(OH)2溶液
稱(cheng)取Ba（OH）2（AR）1克或5克，加雙蒸水100毫升，加熱溶解，冷卻后若不溶物較多，可用粗濾紙過濾，4℃冰箱保存。
14．2 × SSC溶液
稱取(qu)氯化鈉NaCl(AR)17.54克，檸檬酸鈉C6H5O7Na3(AR)8.82克，加雙蒸水至1000毫升。
15．1%酚紅溶液
稱取酚(fen)紅1克，置研缽中逐漸滴加0.05NNaOH 25毫升，不斷研磨至顆粒完全溶解，再加入三蒸水至100毫升。
第三部(bu)分(fen)
人類(lei)染色體標本制備方(fang)法(fa)
一、人體(ti)外周血淋巴(ba)細胞染色(se)體(ti)標本的制(zhi)備（已經商品化）
原(yuan)理：人體(ti)外周血的(de)(de)淋巴(ba)細(xi)胞(bao)是一種已(yi)成熟(shu)的(de)(de)不具有(you)進行有(you)絲分裂(lie)能力(li)的(de)(de)細(xi)胞(bao)，故(gu)不能直接用其制備染(ran)色體(ti)標本。但淋巴(ba)細(xi)胞(bao)在(zai)植(zhi)物(wu)凝集素（PHA）的刺激下，能轉變為具有細胞分裂能力的母細胞。因此，外周血必須經過含有PHA的培養液培養后，才能制備供核型分析染色體標本。
1、淋巴細胞培養液配制
RPMI1640液 80%
小牛血清 20%
PHA 適量（根據(ju)廠家說明書的使用量）
肝素 ; 100單位
雙抗 100單位/毫升
細胞生長因子 適量
Z后將配好培養液的(de)酸堿度調PH=7.2-7.4，在無菌的條件下進行配制分裝。然后進行分裝，每瓶4.5毫升。冰柜保存。
2、采血與培養
用(yong)無菌注(zhu)射器(qi)吸取(qu)0.2%肝素液0.2毫升（或100單位肝素）濕潤針筒，抽取被檢者靜脈血約2毫升，輕輕轉動針筒，使之與肝素混勻，再將解凍至37℃的培養液的瓶蓋用酒精棉球擦凈消毒，直接用注射器從瓶蓋上插入，每瓶接種0.2-0.4毫升的外周血，搖勻后于37℃培養箱培養，如果外周血樣本不需要保留，注射器不需吸取肝素，直接抽血，立即接種到培養瓶內，搖勻后培養。這一方法減少污染機會，同時降低肝素的用量（培養液中已含肝素），肝素量過大，會引起溶血。
3、 秋水(shui)仙素處理
加秋水仙素(su)的時間根據檢(jian)查(cha)目的而(er)定。如果檢(jian)查(cha)放射損傷后(hou)
染色體(ti)(ti)畸變應在培養(yang)44-54小時后加秋水仙素，這樣可避免一部分畸變的染色體丟失；如果用于染色體疾病的診斷，則在培養66-70小時加秋水仙素，以積累更多的分裂中期細胞。
加(jia)秋水(shui)仙素的(de)量在前(qian)面試(shi)劑配備(bei)中已討(tao)論過，這里(li)不(bu)作探(tan)討(tao)。加(jia)入秋水(shui)仙素搖勻后，置37℃培養箱繼續培養4-6小時，終止培養收集細胞。
4、 低滲處理
將培養物倒入10毫升的刻度離心管內，平衡離心、離心速度1000-1500轉/分，時間8-10分鐘。小心吸去上清，加入8毫升預熱37℃的低滲液，用吸管將現溶物打勻，置37℃水浴15-20分鐘。使白細胞膨脹，染色體分散，紅細胞解體。
5、 預固定
低(di)滲后(hou)，立(li)即加入1毫升新配的固定液，輕(qing)輕(qing)打勻，平衡(heng)離(li)心、離(li)心速度1000-1500轉/分，時間8-10分鐘。
6、 固(gu)定(ding)
離心后棄上(shang)清(qing)，留下管(guan)底的細胞，緩慢加入(ru)固定液(ye)約8毫升并輕輕打勻，37℃水浴30分鐘；第一次固定時，先加數滴，輕輕將細胞打勻，再慢慢加至8毫升，打勻，這樣染色體標本的形態較好。平衡離心、離心速度1000-1500轉/分，時間8-10分鐘。
7、 再固(gu)定
離(li)心后，棄上清(qing)，加入8毫升固定液，打勻。于37℃水浴30分鐘，平衡離心、離心速度1000-1500轉/分，時間8-10分鐘。
8、 制片(pian)
離心后，棄上清(qing)，根據沉(chen)淀的(de)細胞量(liang)，加入(ru)適量(liang)的(de)固(gu)定(ding)液(ye)打勻，將細胞懸液(ye)滴入(ru)1-2滴于預凍的干凈玻片中央，隨即吹氣，輕輕過火，氣干。
* 注意事項：
①器皿洗滌一定要干凈，不能有酸堿殘(can)留。
②接(jie)種外周血不(bu)能太(tai)多或太(tai)少(shao)
③培養細(xi)胞(bao)溫度37℃+ 0.5
④秋水仙素一定要避光(guang)保(bao)存，配(pei)制后使(shi)用(yong)期不能超過(guo)半(ban)年，
秋水仙素(su)的(de)處理時間不(bu)要(yao)少于(yu)4小時，也不要超過6小時。
⑤低滲的時間、溫度會(hui)影(ying)響染色體的分(fen)散和(he)分(fen)裂相(xiang)的數目。
⑥離心機Z好用水(shui)平式，轉速過(guo)(guo)快過(guo)(guo)慢直接影響標本片(pian)的(de)質量。
⑦固定液(ye)一定要現(xian)用現(xian)配，固定要徹底(di)，每次(ci)不(bu)少于30分鐘，加固定液(ye)不(bu)能(neng)過快(kuai)，要沿管壁慢慢加入，否則染色體(ti)容易(yi)扭轉(zhuan)；固定作用不(bu)足，染色體(ti)出現(xian)毛刷狀。
⑧玻片(pian)的(de)清潔(jie)度、冷凍溫(wen)度會影(ying)響染色體(ti)的(de)鋪展
二、骨(gu)髓染色(se)體標本(ben)的(de)制備
骨髓染(ran)色體標本制(zhi)(zhi)備通常用(yong)于(yu)白血病(bing)患者，特別是急慢性粒細(xi)胞(bao)(bao)的(de)白血病(bing)的(de)檢查(cha)，也適(shi)用(yong)于(yu)淋巴細(xi)胞(bao)(bao)性白血病(bing)。骨髓細(xi)胞(bao)(bao)處于(yu)生長分裂期，可以直(zhi)接(jie)取樣(yang)制(zhi)(zhi)備染(ran)色體標本片(pian)，為了(le)增加細(xi)胞(bao)(bao)的(de)分裂相數量，可在加入秋水仙素的(de)培養液中作短暫的(de)培養。再收(shou)集(ji)細(xi)胞(bao)(bao)制(zhi)(zhi)備染(ran)色體標本片(pian)，會獲(huo)得較滿意的(de)分裂相數目。
1、骨髓細胞(bao)短期培養法(fa)
培養液配(pei)方(fang)：RPMI 1640 80%
小牛血清 20%
雙(shuang)抗 100單位/毫升
肝素 100單位
配好后(hou)分裝成每瓶5毫升，冰凍保存，用滅菌的注射器從髓骨抽取骨髓液0.2-0.4毫升，直接注入預熱37℃的培養液中搖勻，37℃培養24-48小時后，加入秋仙素（10微克/毫升）0.1毫升，繼續培養4-6小時，終止培養收集細胞。
低滲(shen)、固定、制片等步(bu)驟與(yu)外(wai)周血染色體(ti)標本制備相同。
2、骨髓細胞(bao)直接(jie)制片法
用(yong)滅菌的注射器從隋骨抽(chou)取骨髓(sui)液0.3-0.5毫升，立即注入含秋仙素0.1-0.05微克/毫升的生理鹽水（5毫升）中，用滴
管輕(qing)輕(qing)吸(xi)動(dong)，將骨髓的脂(zhi)肪顆粒(li)充分洗掉，平衡(heng)離心速度1000-1500轉/分，時間8-10分鐘，棄上清。加入含同樣秋水仙素濃度的生理鹽水2-3毫升，37℃放置2-3小時，平衡離心，時間速度同上，棄上清。加低滲液5毫升，打勻后37℃水浴10-15分鐘，離心棄上清，固定、制片的方法按外周血染色體標本制備進行。
3、注意(yi)事(shi)項：
（1）骨髓染色體標片制備的成敗，首先取決于骨髓液，抽取骨髓太少或太稀，細胞數量過少，不易獲得較多的中期細胞，要進行核型分析就更困難了。故要足夠的骨髓量和細胞數。細胞數量要求達3×106/毫升。通常作短期培養能增加細胞數目，提高成功率。
（2）骨髓材料中脂肪顆粒較多，必須充分洗掉，否則影響標片的質量。
三、羊(yang)水細胞染色體標(biao)本的制備
羊(yang)(yang)水細(xi)胞(bao)(bao)染(ran)色體(ti)標本制備技(ji)術，目前已廣(guang)泛(fan)應(ying)用到臨(lin)床(chuang)產前檢查中。羊(yang)(yang)水中的(de)(de)細(xi)胞(bao)(bao)量少，且大(da)多是老化細(xi)胞(bao)(bao)，因此(ci)不能直接制備染(ran)色體(ti)標本，羊(yang)(yang)水細(xi)胞(bao)(bao)的(de)(de)培養是實驗(yan)成(cheng)功的(de)(de)關鍵。
1、羊(yang)水(shui)穿刺取材：（略）
在(zai)有條(tiao)件(jian)(jian)的醫院(yuan)，由專業醫生在(zai)無菌安全條(tiao)件(jian)(jian)，準確定(ding)位，取出羊水20-30毫升。
2、羊水細胞培養：
培養液(ye)配(pei)方：Ham’s F10培養(yang)液(ye) ; 80%
胎牛血清 20%
細(xi)胞生長因子 適量
雙抗 100單位/毫升
調PH=6.6-6.8，無菌條件配制，分裝冰凍備用。抽取的羊水在無菌條件下，平衡離心，離心速度1000-1200轉/分鐘，時間8-10分鐘，棄上清，留下1毫升上清與沉淀的細胞打勻，接種到25毫升方形的培養瓶內，加入5毫升預熱37℃的羊水培養液，輕輕打勻，置37℃培養箱（Z好采用CO2培養(yang)箱(xiang)）。靜止培養(yang)6-7天。接種量，通常10毫升羊水的細胞接種一瓶。
3、6-7天后，鏡下觀察細(xi)(xi)胞生長情況，若羊水細(xi)(xi)胞已貼壁(bi)，并形成許多(duo)細(xi)(xi)胞小(xiao)島，即進行換液。
4、換液(ye)時(shi)，輕(qing)輕(qing)吸去舊的培養液(ye)，加(jia)入新鮮的培養液(ye)5毫升(sheng)
5、細胞換(huan)液后生長加快，隔日(ri)觀察，當細胞生長旺盛，出現許多透亮(liang)圓形飽滿的細胞時（一般約為14-30天），可收集細胞進行染色(se)體(ti)制片(pian)。
6、若換(huan)液后，細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)生長緩慢，仍舊(jiu)只有幾個孤立細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)小島，或(huo)者細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)形態只有成片(pian)的(de)樹皮狀的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，無圓(yuan)形的(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)出(chu)現。就要進行原瓶傳(chuan)代或(huo)換(huan)瓶傳(chuan)代：倒去培養液，加入1-2毫升(sheng)EDTA胰酶，于37℃作(zuo)用(yong)1-2分(fen)鐘，輕(qing)輕(qing)吸去胰酶液，加入5毫升(sheng)培養液，輕(qing)輕(qing)將細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)打勻，或(huo)換(huan)上新瓶或(huo)用(yong)原來的(de)瓶，37℃靜止培養，3天后觀(guan)察細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)生長旺(wang)盛(sheng)，出(chu)現較多雙圓(yuan)形細(xi)(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)時可進行染(ran)色體(ti)制片(pian)。
7、收(shou)集(ji)細胞(bao)前5-6小(xiao)時，加入(ru)秋水(shui)仙素，終(zhong)(zhong)濃度(du)為0.1微克(ke)(ke)/毫(hao)升，或(huo)或(huo)收(shou)集(ji)細胞(bao)前16-18小(xiao)時，加入(ru)秋水(shui)仙素，終(zhong)(zhong)濃度(du)0.02-0.05微克(ke)(ke)/毫(hao)升，37℃繼(ji)續培養(yang)。
8、倒去培養(yang)液(ye)，加入(ru)EDTA胰(yi)酶(mei)1-2毫(hao)升(sheng)。鏡下觀察胰(yi)酶(mei)作用(yong)情(qing)況，當細胞收縮變(bian)圓時(shi)候，立即輕輕倒去胰(yi)酶(mei)，加入(ru)5毫(hao)升(sheng)生理(li)鹽(yan)水(shui)，輕輕將瓶壁的(de)(de)細胞吹打脫落，平(ping)衡離心速度(du)1000-1200轉/分。時(shi)間8-10分鐘。棄鹽(yan)水(shui)上清(qing)。然后進(jin)行低滲(shen)處理(li)，低滲(shen)、固(gu)(gu)定(ding)、制片等步驟與外周血染色(se)體(ti)標本(ben)(ben)制備基本(ben)(ben)相同，所不同的(de)(de)是，低滲(shen)液(ye)、固(gu)(gu)定(ding)液(ye)的(de)(de)每(mei)(mei)次使用(yong)量每(mei)(mei)管(guan)3-5毫(hao)升(sheng)，以減(jian)少(shao)細胞損失(shi)。由于羊(yang)水(shui)細胞易破(po)，故操作的(de)(de)力度(du)一定(ding)要輕，只能用(yong)氣吹打，不能吸打。
* 注意事(shi)項：
①抽(chou)取妊(ren)娠(shen)16-20周的羊(yang)(yang)水Z好，月(yue)份過(guo)小羊(yang)(yang)水不足，月(yue)份過(guo)大(da)羊(yang)(yang)水細胞(bao)老化(hua)不易培養成功。
②抽羊(yang)(yang)水(shui)前翻(fan)動孕婦的(de)身體，以(yi)取(qu)得較(jiao)多(duo)的(de)羊(yang)(yang)水(shui)細胞。
③培養液的(de)胎牛血清的(de)質量十分關鍵。
④培養開(kai)始4天內不要翻動，以免影響細(xi)胞貼壁(bi)
⑤收集細胞(bao)的(de)(de)時(shi)機要(yao)掌握好，生長不(bu)夠(gou)旺(wang)盛的(de)(de)，形態(tai)成樹皮狀的(de)(de)細胞(bao)收不(bu)到分裂(lie)相，只有生長旺(wang)盛且(qie)呈現較多圓形透亮的(de)(de)細胞(bao)時(shi)，才能收到較多的(de)(de)中期細胞(bao)。
四、染色體顯帶技術
染(ran)色體(ti)顯(xian)帶(dai)技術常用的有熒光Q-帶、Giemsa G-帶、異染色質的C-帶等。這里介紹較為常用的Giensa G -帶C-帶技術。
1、G-顯帶(dai)染色體標本(ben)的制備
方(fang)法(fa)一：
（1）將配制好的0.25%的胰蛋白酶溶液60毫升倒入立式染色缸內，37℃水溶預熱，用3% Tris調PH=7
（2）將標本片浸入胰酶溶液中，不斷輕輕擺動，新鮮標本只需處理3-9秒鐘，老標本則需處理3-5分鐘。
（3）立即投入1：10或1：20的Giemsa工作液，染色15-20分鐘
（4）自來水沖凈，氣干。
方法二：
（1）45毫升生理鹽水或雙蒸水倒入立式染色缸內，加入已配好的2%胰酶液5毫升，用3% Tris溶液調PH=7于37℃預熱。
（2）把染色體標本片浸入37℃上述胰酶工作液中，略加搖動，處理30秒左右。
（3）取出后立即用1：10Giemsa工作液染色8-10分鐘，自來水沖凈。
* 注意事項：
①胰酶的品(pin)質會(hui)直接影(ying)響(xiang)顯(xian)帶的質量，購買品(pin)牌試劑較保險。
②胰酶的活性與PH值和溫(wen)度(du)(du)有關，在PH=7溫(wen)度(du)(du)37℃狀態
下，胰酶活性Z高。
③胰酶處理(li)時間長(chang)短(duan)與標(biao)本(ben)片(pian)片(pian)齡(ling)有關，新(xin)鮮的(de)(de)標(biao)本(ben)處理(li)時間短(duan)，且帶(dai)紋較清晰(xi)，建議標(biao)本(ben)片(pian)的(de)(de)片(pian)齡(ling)在2-7天內較適宜。
④Giemsa工(gong)作液要(yao)現用現配(pei)
⑤胰酶工作液長時間(jian)置37℃水浴，容易渾濁污染，應棄之。
2、C-帶染色體標本的制備
C顯(xian)(xian)帶(dai)(dai)特點：對染(ran)(ran)(ran)(ran)色(se)(se)(se)體(ti)中的(de)(de)結(jie)構性異染(ran)(ran)(ran)(ran)色(se)(se)(se)質容易染(ran)(ran)(ran)(ran)色(se)(se)(se)，對常染(ran)(ran)(ran)(ran)色(se)(se)(se)質只能顯(xian)(xian)示(shi)較(jiao)淡的(de)(de)輪廓。C顯(xian)(xian)帶(dai)(dai)所(suo)顯(xian)(xian)示(shi)著色(se)(se)(se)較(jiao)深(shen)的(de)(de)結(jie)構部(bu)(bu)位(wei)：①各(ge)染(ran)(ran)(ran)(ran)色(se)(se)(se)體(ti)的(de)(de)著絲粒；②各(ge)近端著絲粒的(de)(de)部(bu)(bu)位(wei)；③在(zai)1、9、16號(hao)染(ran)(ran)(ran)(ran)色(se)(se)(se)體(ti)具有次縊痕的(de)(de)位(wei)置(zhi)上；④Y染(ran)(ran)(ran)(ran)色(se)(se)(se)體(ti)的(de)(de)長臂遠(yuan)端，此部(bu)(bu)分系Y染(ran)(ran)(ran)(ran)色(se)(se)(se)質部(bu)(bu)分。其(qi)它部(bu)(bu)分著色(se)(se)(se)很(hen)淡。
核型分(fen)析過(guo)程，對某些(xie)染色體變(bian)異問(wen)題，往往需要C顯帶技術與G顯帶技術結合分析，更能準確判斷染色體的畸變。
方法一：
（1）將常規制備染色體標本片放入0.2NHCL溶液中，室溫下，處理15-30分鐘。
（2）自來水沖凈后，再將標本片浸入預溫到65℃的5% Ba(OH)2溶液中，處(chu)理(li)10分鐘。
（3）自來水沖凈后，再把標本片投入預溫到65℃的2×SSC溶液中，處理1-1.5小時；
（4）自來水沖凈后，用1：10 Giemsa工作液染色0.5-1小時。
（5）自來水沖凈，氣干。
方(fang)法二(er)：
（1）將制好的標本片放入0.2N HCL中，室溫下1小時。
（2）水洗凈（均用自來水沖洗）
（3）浸入1% Ba(OH)2水溶液中，溫度預熱到50℃，處理時間15-20秒。
（4）水洗凈
（5）浸入預溫到60℃的2×SSC溶液中，處理90分鐘。
（6）用水徹底沖凈；
（7）1：10 Giemsa染色液染色10-15分鐘
（8）水沖凈、氣干。
* 注意事項：
①標本片年(nian)齡(ling)不能超過一個月(yue)
②各種(zhong)處理溶液一定要(yao)達到所需的溫度時，才放(fang)入表(biao)本片進(jin)行處理
③每一步處理后(hou)，要立即用自來(lai)水(shui)徹底沖凈后(hou)，才進行下一步處理。
3、R帶技(ji)術
（1）試(shi)劑
①pH6.8PBS：溶(rong)液A——1/15mol/LKH2PO4、溶(rong)液B——1/15mol/LNa2HPO4。pH6.8PBS為1000毫(hao)升A液加900毫(hao)升B液。
②Earles液(ye)：溶液(ye)A—NaCl6.80克、KCl0.40克、NaH2PO4·H2O0.14克、蒸餾水800毫(hao)升。
溶液B—無水CaCl20.20克、MgCl·6H2O0.17克、蒸餾水200毫升。
將溶液A倒入溶液B中，混合后即可。
③Hoechst-33258原液：Hoechest-332582毫克，蒸餾水4毫升。
Hoechest工作液：200毫升(sheng)1/15mol/LPBS加(jia)0.75毫升(sheng)原液。
④吖啶(ding)橙(cheng)（acridineorange）
配(pei)制pH6.5PBS：
溶液A——0.07mol/LNa2HPO4·12H2O、溶液B——0.07mol/LKH2PO4。將32毫升A液和68毫升B液混合。
吖(a)啶橙工作液：0.1克吖啶橙于100毫升0.07mol/LPBS中。
⑤胸腺(xian)嘧啶(ding)核苷（Thymidine）：使Z終濃度為每毫升為0.3毫克。
⑥5-溴脫氧(yang)尿嘧啶核(he)苷（BrdU）：使Z終濃(nong)度為3×10-5mol/L。
2.顯帶步驟
（1）所制標本在Hoechst工作液中，浸染20分鐘或在吖啶橙工作液中浸染5分鐘，再用PBS沖洗2次。
在同步(bu)比培養細(xi)胞(bao)時，進行(xing)BrdU處理，使BrdU在DNA復制時滲入到胸腺嘧啶的位置，又因BrdU是一種淬滅劑，凡有BrdU的區域都能使吖啶橙和Hoechst熒光染料減弱，這對于顯帶清晰有幫助。
（2）標本上鋪滿1/15mol/LPBS，放在45℃鐵(tie)板上，用8W紫外燈，燈距為5厘米，照射15—20分鐘后，蒸餾水洗2次。
紫(zi)外光的照射造成鄰近胸腺嘧啶形成二聚體，即TT，這樣減少了AT間的氫鍵，使富于AT的DNATm值下降，也就是這部分的DNA更易變性。
（3）標本在86℃水浴(yu)鍋(guo)中的(de)Earles液中處理1—2分鐘后，蒸餾水洗2次。處理時間和氣溫及標本齡、光照有關。
R顯帶過(guo)程(cheng)中的(de)熱處理是重要的(de)步(bu)驟，86℃是適宜的溫度，使(shi)富于AT的DNA變性而使富于GC的DNA保持原狀。
（4）用pH6.8PBS配制5％Giemsa染色5—10分鐘，水洗，空氣干燥。
（5）在顯微鏡高倍目鏡下檢查顯帶標本（見圖26-1，C），R帶是與G帶相反的帶型，R帶是富于GC堿基對的DNA，是S期早復制的DNA，而其帶間是富于AT堿基對的DNA，是S期晚復制的DNA。在顯微鏡下可以看到比G帶更明顯的帶型，另外大部分染色體端部為深染，還有若兩條X染色體中的一條為晚復制時，呈淡染。這對于染色體間易位和對X染色體失活和晚復制關系的研究將有D特的功能。若在顯微鏡下呈現一片淡染，可考慮光照時間和處理時間兩者之比例。
4、染(ran)色體(ti)脆性位點顯示技(ji)術
（1）試(shi)劑
①培養液：93毫升mol/L199＋5毫升透析小牛血清＋1毫升2mol/LHepes＋1毫升10-5mol/LFUdR＋2×104單位青霉素、鏈霉素，pH7.6—7.8。
②氨甲(jia)喋呤（amethopterin），使Z終濃度為10-7mol/L。
③BrdU，使Z終濃度達3×10-5mol/L。
④秋水酰胺，Z終濃度(du)為每毫升0.07微克。
（2）標(biao)本制備(bei)
人體培養(yang)細胞(bao)在(zai)培養(yang)瓶中匯合(he)三分之二時，淋巴細胞(bao)培養(yang)至72小時，加入氨甲喋呤，Z終濃度為10-7mol/L，繼續進行同步化培養17小時，用Hanks液清洗2次，加入新鮮培養液，在淋巴細胞換入的培養液中仍需含有PHA，但在換入培養液去掉FUdR，而加入BrdU，Z終濃度達3×10-5M，繼續培養5小時，隨即加入秋水酰胺，Z終濃度為每毫升0.07微克，2小時后按常規收細胞，空氣干燥制片。
（3）顯示脆性位(wei)點：用(yong)pH6.8PBS配制3％Giemsa染色10分鐘，水洗，空氣干燥。
（4）鏡(jing)檢：在顯微鏡(jing)高倍(bei)目(mu)鏡(jing)下觀察100個分裂中期有3—30個染色體上發現有脆性位點（見圖26-1，D），主要特征為具有寬度不等的非染色裂隙，常涉及兩個染色單體，此外，可出現無著絲粒片段缺失以及三相交換體征象（friradialfigure）。脆(cui)性(xing)位點可(ke)能是富含胸腺嘧(mi)啶的DNA節段，因此當脫氧胸苷三磷酸庫（dTTP）耗竭時，可造成這一節段在有絲分裂時不能緊密折疊，甚至出現裂隙或斷裂，表現出鏡下可見的脆性位點。如在細胞培養液中去除葉酸和胸腺嘧啶，或加入二氫葉酸還原抑制劑（如氨甲喋呤）和5-氟脫氧尿嘧啶核苷（FUdR）、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU），可使脆性位點細胞表達頻率明顯增高，說明脆性位點的產生與DNA的這一合成代謝過程受阻有關。此外培養液的pH對提高脆性位點的檢出率是非常重要的。因為在不同pH條件下，葉酸具有不同的離子形式，其進入細胞的運轉速率也就不同，而胸腺嘧啶的攝入同樣受pH的影響，因此在選擇適當培養液的同時注意pH的影響。
5、Giemsa分化染色技(ji)術
（1）試劑：Giemsa原液制備（參見P8）：
（2）標本制備
常規(gui)制片(pian)(pian)(pian)，細胞懸液滴片(pian)(pian)(pian)時為(wei)一般片(pian)(pian)(pian)的(de)1/3密度。用乙
醇-0.2mol/LHCl洗一下標本。
(3) 顯色過程
①標本浸在60℃蒸餾水中2小時。
②制備染色(se)液，47毫升pH11.3，0.05mol/LPBS＋3毫升Giemsa原液，混和后用濾紙過濾，在37℃水(shui)浴(yu)鍋(guo)中預溫(wen)。
③標本浸(jin)到37℃Giemsa染(ran)液中1—6分鐘、標本(ben)齡長時適(shi)當延長染(ran)色(se)時間(jian)。
④鏡檢：在顯微鏡高(gao)倍目鏡下觀察，靈長類的(de)染(ran)色(se)體呈現淡(dan)藍色(se)，伴有一(yi)些特定的(de)異染(ran)色(se)質呈品紅(hong)色(se)。嚙齒類染(ran)色(se)體會被染(ran)成品紅(hong)色(se)。
五、實驗(yan)結果
通過染(ran)色(se)體(ti)分化(hua)染(ran)色(se)，可以在(zai)染(ran)色(se)體(ti)上顯示出(chu)各種帶(dai)型及脆性(xing)位點，有(you)利(li)于(yu)對染(ran)色(se)體(ti)遺傳(chuan)病的診斷，尤(you)以X染色體長臂末端2區7帶和2區8帶之間或附近的一個特定脆性位點，它表現了非特異性X連續的智力低下，被稱為脆性X染色體綜合癥，可以給于葉酸治療，這一發現將會使許多不明原因的智力低下患者得以診斷和治療。Giemsa11帶又可用于人類細胞和嚙齒類細胞融合后所得雜種細胞的檢定。再者染色體分化染色一般公認為是DNA與蛋白質的相互作用，而且顯帶是一種染料特異現象，為此染色體分化染色不僅是一個具有巨大價值的實用手段，而且對染色體組成的特定水平也將提供重要資料。
第(di)四(si)部分
探討(tao)染(ran)色(se)體標本制備技術中的(de)若(ruo)干(gan)問題(ti)
1、為什么有的培養基的顏色較深(shen)，有的較淺？
答(da): 培養基的紅色來自成分中的酚紅，因為它的變色范圍較適合作培養基的酸堿度指示劑。它在PH≥7時，顏色由紅變深紫色，PH≤7時，顏色則由紅色逐漸變成黃色。外周血的培養液PH=7.2-7.4。另外，不同廠家出廠的同一種培養基，因配方的酚紅含量各有差異，使培養液的紅色深淺略有差異，但不影響培養效果。
2、為什么外(wai)周(zhou)血培(pei)養時(shi)間要68-72小(xiao)時(shi)？
答(da): 外周血淋巴細胞在體外培養中，受到培養液中的PHA刺激，獲得有絲分裂能力，經過68-72小時的培養后，大多數淋巴細胞進行了三次分裂增殖，數目達到制備標本片的要求。培養時間過短，細胞量不足，培養時間過長，細胞老化，營養耗盡，又浪費時間。實驗證明，68-72小時的培養，效果Z為理想。
3、有的標本(ben)片，分裂(lie)相很多(duo)，但染色體(ti)(ti)“瘦(shou)小”，是(shi)不是(shi)培養(yang)液營養(yang)不良引起(qi)？
答(da): 淋巴細胞一定要在良好的營養環境中才能生長增殖，分裂相多，說明了淋巴細胞生長旺盛，染色體“瘦小”，是因為在制片過程中，染色體的蛋白結構發生異固縮造成的，起因可考慮為以下幾個原因：
① 秋水仙素濃度是否過(guo)高，或處理時間是否過(guo)長(chang)？
② 加固(gu)定液的速度不要過快，有時瞬間的固(gu)定，會使蛋白(bai)結(jie)構產(chan)生固(gu)縮現(xian)象。
③ 固(gu)定液中的(de)甲醇、冰醋酸是(shi)否(fou)有質量上(shang)的(de)改變。
④ 可以適當加大固定液中的冰醋酸的比例，如甲醇∶冰醋酸=3∶1.5（或2）
4、配備好的培養基(ji)一般能保(bao)存(cun)多長時間？
答: 培養基保質期與貯存溫度有關，貯存溫度在-20℃（普通冰
箱冰格層）可以保存半(ban)年至1年；貯存溫度在-70℃以下，可以保存1-2年。
5、培(pei)養基的接種溫度對細胞(bao)培(pei)養有影響嗎？
答: 接種前，應該將培養基預熱至37℃才接種。若培養基接種溫度低于4℃，容易造成細胞破裂（尤其是紅血球）。影響培養效果；另外培養基的接種溫度如果低于10℃，往往造成細胞進入半休眠狀態，影響細胞培養周期，使分裂相減少。
6、抽取的外周血是否需(xu)要(yao)抗凝？
答: 我們配制的培養基已含有肝素，若待檢的樣品可以立即接種不需保留的，抽血時不需添加抗凝劑。方法是將抽取的外周血立即接種到培養液中，馬上搖勻后放到37℃培養箱中培養。若待檢的樣品不能馬上接種或要保留樣品的，應抽血前加入適量的抗凝劑，抽完血后馬上搖勻，再進行接種。
注意：抗凝劑過(guo)多會影響培養效果（在(zai)前面的(de)試劑介紹中(zhong)已討論過(guo)）。
7、抽取的血液(ye)樣本能保留(liu)多長(chang)時間(jian)？
答: 首先強調的是，外周血的樣品越新鮮培養效果就越好，一些特殊病例需要保留樣品作備用，應將添加過抗凝劑的外周血樣品放在4℃-10℃冰箱中保存，保存期為3天左右。超過七天后接種，培養效果很差。
8、經制片后的細胞懸(xuan)液(ye)能保存多長時間？
答: 細胞懸液可密封后保存在4℃或－20℃，4℃保存一個月內，－20℃保存2年內滴片制成的標本片仍可進行G顯帶；－20℃保存3年細胞懸液仍可進行熒光雜交。
9、為(wei)什么外周血培養過(guo)程中有時會出現凝(ning)血現象(xiang)？
答: 在實驗過程中下列原因可能會導致培養后的血液出現凝血現象：
①培養液中的PHA含量(liang)過高。
②培養液中的肝(gan)素使用量不足或效價下降。
③接種后，沒有(you)立(li)即降外周血與培養(yang)液充分搖勻。
10、為什么外周血培養有時會(hui)出現溶血情(qing)況？
答(da): 在實驗過程中下列原因可能會導致培養后的外周血溶血：
①細菌污染。
②PHA和(he)肝素過量。
③外周(zhou)血樣品(pin)不新鮮。
11、為(wei)什(shen)么有個(ge)別(bie)樣品出現不明(ming)原因(yin)的(de)無(wu)分(fen)裂相的(de)現象？
答(da): 由于有個別病人可能服用過抑制白細胞分裂增殖的藥品（如白血病病人），這類病人的樣品往往經培養后，白細胞仍受到藥物抑制而不進行分裂增殖，因此標本片很難找到分裂相，建議停藥一個月以上再作染色體檢查。
第五部分
附 錄
一、染色體實驗(yan)應用(yong)
1．姐(jie)妹染色體交換核型分析
2、職業(ye)病等微核(he)分析
3、染色體遺傳病分析
4、白血病病人診斷參(can)考分析(xi)
5、細(xi)胞生物學教學
6，染色體(ti)脆性觀察(cha)
二、染色(se)體實驗用(yong)品報價單
組建染色體(ti)實驗室和染色體(ti)分析系統(tong)請參考公司(si)網(wang)站。
三、 聯系方式(shi)
網址: //water-systems.cn 郵箱：sj_gy17@163.com
電話(hua)： 021-51093712
