1前言
冷凍(dong)干(gan)燥廣泛用(yong)于制(zhi)備治療(liao)性蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)質制(zhi)劑(ji)，蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)凍(dong)干(gan)制(zhi)劑(ji)可以提供更(geng)好的保(bao)質期，方便藥物的儲藏和運輸，然而(er)，蛋(dan)(dan)白(bai)(bai)在凍(dong)干(gan)過程(cheng)中存在許多應(ying)力(li)，包括低溫應(ying)力(li)、凍(dong)結應(ying)力(li)(枝狀冰晶的(de)形成、離子強度的(de)增加(jia)、pH值的(de)改變、相分離等)、干燥應力(失去蛋白質(zhi)表面水分子(zi))等，這(zhe)些(xie)應(ying)力常常直(zhi)接(jie)或間接(jie)導致蛋白(bai)質類(lei)藥物失去天然構象從而變性或失活。所以即使(shi)采用了(le)冷凍(dong)干燥這(zhe)種溫(wen)和的(de)干燥方式，還需要加入合適的(de)凍(dong)干保護劑以很好的(de)保護蛋白(bai)穩(wen)定(ding)性。
冷凍(dong)干(gan)燥保護劑對(dui)于蛋(dan)白質的保護原理(li)已經被研究(jiu)討論了(le)幾十(shi)年，形(xing)成(cheng)了(le)一些(xie)被普遍接(jie)受的共識。如(ru)在凍(dong)結階段，Z主要的假說為(wei)“優先(xian)化作用”;在干燥階段Z主要(yao)的有2種假說(shuo)，即“玻璃化”和“水置換(huan)”。
冷凍干燥保護(hu)(hu)劑的分類方式(shi)很多(duo)，有文獻中提(ti)出了一個公(gong)式(shi)化模(mo)型，按照功能把(ba)冷凍干燥保護(hu)(hu)劑分類，包括5類: ①pH緩沖劑(ji)，如Tris、組氨酸、枸櫞酸等;②配體(ti)，可以優化蛋白質的熱(re)力學(xue)穩定性(xing);③穩定劑，一般是雙(shuang)糖，如蔗(zhe)糖、海藻糖等，可(ke)通(tong)過抑制蛋白質的展開和提供玻璃(li)基質起保護(hu)作用;④非離子表面(mian)活性劑，可減(jian)少蛋(dan)白質(zhi)的聚(ju)集(ji);⑤填充劑，如甘(gan)露醇、甘(gan)氨酸(suan)、羥乙基淀粉、血清白蛋(dan)白等，可提高產品的物理成型性。這(zhe)里(li)我們簡要(yao)介紹其中幾種。
2緩(huan)沖鹽
首(shou)先，蛋白質穩定(ding)性受環境pH的影響，緩沖液選(xuan)擇(ze)在蛋白質(zhi)制劑的開發(fa)過程中是Z關鍵的，并且必須在配(pei)制階段建立(li)。在選(xuan)擇(ze)緩沖液pH時(shi)，建議pH不(bu)要太接近蛋白質的(de)pI(等(deng)電點(dian))以避免聚集。
磷酸(suan)鹽是蛋(dan)白質配方中Z常見(jian)的緩沖劑之一，特別是含水蛋(dan)白質藥物，有效pH值范(fan)圍為5.8-8.0，并且具(ju)有生物相容性(xing)。然而(er)，正如“冷凍過程中(zhong)的pH變化”所討論(lun)的那樣，磷酸鹽緩沖液(ye)，特別是磷酸氫二鈉，在冷凍過(guo)程中會(hui)發生顯著的pH變化，因(yin)此不推薦(jian)用(yong)于(yu)pH敏感蛋白質。相(xiang)反，磷(lin)酸鉀，組氨酸，三(san)羥甲基氨基甲烷(Tris)和(he)檸檬酸(suan)鹽緩沖液在冷凍期間顯(xian)示出Z小(xiao)的(de)pH變化。此外，低緩沖液濃度可有助于降低pH變化。組氨(an)酸是一種氨(an)基酸，有效pH范(fan)圍(wei)為5.5-7.4，它與生物pH相(xiang)容，并且經常用于冷凍(dong)(dong)干(gan)燥的蛋(dan)白(bai)質。然(ran)而，選擇適當的冷凍(dong)(dong)干(gan)燥水性(xing)制劑(ji)，包括緩沖劑(ji)，取決于蛋(dan)白(bai)質的要求及其給藥(yao)途徑。因此，需要許多研究(jiu)和各種(zhong)生物物理方法來篩選出幾(ji)種(zhong)緩沖液的濃度列表(biao)。蛋(dan)白(bai)藥(yao)物凍(dong)(dong)干(gan)保(bao)護劑(ji)分類在(zai)冷凍(dong)(dong)干(gan)燥機(ji)應用欣諭凍(dong)(dong)干(gan)官網(wang)www.xinyu17.com
3填(tian)充劑
為了保證冷凍(dong)干燥后形(xing)成(cheng)良好(hao)的(de)配(pei)方結(jie)構(gou)防(fang)止產品塌陷，同時改善(shan)配(pei)方溶解性(xing)，冷凍(dong)干燥保護劑中還(huan)需要加(jia)入填充(chong)劑。首先，填充(chong)劑在復溶時應該是充(chong)分(fen)可溶的(de)并且與(yu)制劑中的(de)蛋(dan)白(bai)質藥物(wu)相容。此外，它們沒(mei)有(you)毒性(xing)問題并且具有(you)高(gao)共晶/共熔(rong)溫度(Teu)，可有效(xiao)提高冷凍干燥(zao)效(xiao)率。
甘氨酸和甘露醇經常用(yong)作(zuo)凍干蛋白質(zhi)制劑的填(tian)充(chong)劑。甘氨酸在用(yong)作(zuo)填(tian)充(chong)劑時具(ju)有(you)(you)優勢，因為它是無毒的。它具(ju)有(you)(you)高共晶/共熔(rong)溫度(Teu)，可實(shi)現GX冷凍干燥和高溶解度。
甘(gan)露(lu)醇具(ju)有與甘(gan)氨酸相同的(de)優(you)點(dian)，并且對特定蛋白質藥物如LDH和轉化(hua)生長因子-b1具有穩定作(zuo)用(yong)，其(qi)穩定效果取(qu)決于其(qi)濃度。因此，在選擇填(tian)充劑時，應仔細考慮穩定效果以及粉(fen)餅外觀。大多數氨基酸(suan)容易結(jie)(jie)晶(jing)并且可以潛在地用(yong)作(zuo)填(tian)充劑以穩定蛋白質，然而(er)，酸(suan)鹽(yan)的形成(cheng)阻礙了它們的結(jie)(jie)晶(jing)。 NaCl是另一種(zhong)結晶劑，但其(qi)共熔溫(wen)度(Teu)相對于其(qi)他(ta)填充劑的而言太低，因此不推薦使用。
對(dui)于填(tian)充(chong)劑，應(ying)考慮退(tui)火步驟。甘(gan)(gan)氨(an)酸和甘(gan)(gan)露(lu)糖醇在(zai)冷凍干燥過程中應(ying)以結晶形式(shi)存在(zai)。 但是在冷凍(dong)步驟(zou)期間，過冷卻誘導兩種填充劑(ji)以無(wu)定形形態凍(dong)結，容(rong)易導致粉餅(bing)塌陷。另外，在沒有退火的情(qing)況下，填充劑(ji)可以在初級干燥期間重結晶造(zao)成西林瓶破裂，特別是當(dang)制劑(ji)中包含(han)高濃度的甘(gan)露醇時(shi)。填充劑(ji)應(ying)在非晶相的玻璃(li)化轉變溫度(Tg’)和填充(chong)劑的共熔溫度(Teu)之間進行有效結晶(jing)，而退(tui)火時(shi)間取決于填充(chong)劑濃度及其性質(zhi)。 對于甘露醇(chun)和甘氨酸(suan)，填充(chong)高(gao)度在1cm時，推薦在(zai)-20或-25℃和2小時。
4糖類(lei)
糖(tang)類是凍(dong)干蛋白(bai)質制(zhi)劑中(zhong)Z常(chang)用(yong)的(de)賦(fu)形劑，因(yin)為它(ta)(ta)們的(de)結構(gou)中(zhong)具有(you)許多羥基，因(yin)此可以(yi)通(tong)過取代蛋白(bai)質和(he)水之間的(de)氫鍵來提供穩(wen)定效果。此外，大多數糖(tang)在正(zheng)常(chang)冷凍(dong)干燥條件下(xia)不(bu)(bu)結晶，導(dao)致凍(dong)干蛋白(bai)質制(zhi)劑更(geng)快(kuai)速(su)復溶(rong)。還原性糖(tang)通(tong)常(chang)不(bu)(bu)用(yong)于冷凍(dong)干燥，因(yin)為它(ta)(ta)們通(tong)過美(mei)拉德反(fan)應(ying)與(yu)蛋白(bai)質反(fan)應(ying)，然(ran)而，當它(ta)(ta)們的(de)穩(wen)定性效果優于其他賦(fu)形劑時(shi)，它(ta)(ta)們可以(yi)使用(yong)。蔗(zhe)(zhe)糖(tang)已(yi)廣泛用(yong)于蛋白(bai)質制(zhi)劑配方，海藻(zao)糖(tang)被認為是比蔗(zhe)(zhe)糖(tang)更(geng)優異(yi)的(de)凍(dong)干保護劑，因(yin)為它(ta)(ta)具有(you)更(geng)高的(de)玻璃(li)化轉變溫(wen)度(Tg’)。海藻(zao)糖還具有其(qi)他優點，例如低(di)吸濕性，不存(cun)在內部氫鍵，從而與蛋(dan)白(bai)質的(de)氫鍵更靈活，化(hua)學(xue)反應性低(di)。蔗糖和海藻(zao)糖的(de)高粘度也可(ke)降低(di)在高于玻璃化(hua)轉變溫度(Tg’)的溫(wen)度下干燥期間的蛋(dan)白質(zhi)變性速率，從(cong)而提高冷(leng)凍干燥效(xiao)率。
5其他(ta)
多元(yuan)醇(chun)廣泛(fan)用于蛋白(bai)(bai)質(zhi)穩定劑(ji)，因為它們可以通過其羥基穩定蛋白(bai)(bai)質(zhi)。多元(yuan)醇(chun)已被用作冷凍保護劑(ji)和凍干保護劑(ji)。例如，在凍融期間，LDH在不同程(cheng)度上受甘油，木糖(tang)醇，山梨(li)糖(tang)醇和甘露醇的保護。
聚合物已被用作蛋(dan)(dan)白(bai)質溶(rong)液和凍干制劑(ji)的保護劑(ji)。血清白(bai)蛋(dan)(dan)白(bai)是用于蛋(dan)(dan)白(bai)質藥(yao)(yao)物開發的Z廣泛使用的聚合物之一(yi)，作為(wei)凍干保護劑(ji)和冷(leng)凍保護劑(ji)。許多上市蛋(dan)(dan)白(bai)質藥(yao)(yao)物含有不同量的白(bai)蛋(dan)(dan)白(bai)(表(biao)1)。但是，血(xue)清白蛋白具有與血(xue)源性病原(yuan)體相(xiang)關的(de)潛在(zai)污(wu)染物(wu)，限制(zhi)了其在(zai)蛋白質藥物(wu)制(zhi)劑(ji)中的(de)使用(yong)。因此，建議rHA替代血清白蛋(dan)白。Z終，建議在沒有白蛋(dan)白的情況(kuang)下開發蛋(dan)白質藥(yao)物。
在冷凍步驟中(zhong)，形成冰水界面(mian)(mian)(mian)可(ke)能(neng)導致蛋白質表(biao)面(mian)(mian)(mian)變性。表(biao)面(mian)(mian)(mian)活性劑降(jiang)低蛋白質溶(rong)液的表(biao)面(mian)(mian)(mian)張力(li)，保(bao)護其免受表(biao)面(mian)(mian)(mian)變性。Z廣泛使用的表(biao)面(mian)(mian)(mian)活性劑之一是Tween 80。蛋(dan)白藥(yao)物凍(dong)干保護劑分類在冷凍(dong)干燥機應用(yong)
6小結
已經有超過50%的蛋(dan)白質(zhi)藥物產品選擇冷凍(dong)干燥，因為在固態下，蛋(dan)白質(zhi)藥物的物理和化(hua)學(xue)降(jiang)解減(jian)少，從而保證了(le)其(qi)長期(qi)穩定性。不同(tong)結構和性質(zhi)的
冷凍干(gan)燥保護(hu)劑對冷凍干(gan)燥的不同階段保護(hu)蛋白質的保護(hu)機制(zhi)不同， 聯合使用時對某些蛋白質有協同保護作用，所以，了解常用凍保護劑種類和性質對于開發更有效的蛋白制制劑至關重要的。water-systems.cn欣諭凍干官網
